click here to read INNOLAB on-line version
bi-lingual (Thai-English) magazine
read INNOLAB on-line  l   annual subscription  l   get e-news  l   event calendar  l   advertising  l   share your expertise  l   home



Read the article "Cell Injury and Methods of Analysis"
in English version, click >>>
.

Read full version of INNOLAB #11.62,
click >>>


Follow our activities on-line. Please click like our fan page and take a tour at
www.facebook.com/innolabmagazine
Cell Injury and Methods of Analysis


การอยู่รอดของแบคทีเรียถูกกำหนดโดยความสมดุลระหว่างความเครียด (stress) ที่แบคทีเรียได้รับจากสภาพ แวดล้อมภายใน (เรียกว่า intrinsic) และได้รับจากสภาพแวดล้อมภายนอก (เรียกว่า extrinsic) ความเครียดเหล่า นี้แบ่งเป็นหลายประเภท ได้แก่ ทางเคมี (เช่น กรด สารกันเสีย สารทำความสะอาด) กายภาพ (เช่น อุณหภูมิ แรงดัน ออสโมติก การฉายรังสี) หรือโภชนาการ (เช่น การขาดแคลนอาหาร) และสามารถเกิดขึ้นในช่วง (stage) ใดๆ อย่าง ต่อเนื่องตั้งแต่ฟาร์มไปจนถึงโต๊ะอาหาร

     หลังจากสัมผัสความเครียดอย่างใด อย่างหนึ่งหรือหลายชนิด ส่วนหนึ่งของ ประชากรแบคทีเรียจะบาดเจ็บมากน้อย ต่างกันตามระดับของความเครียด และ ขึ้นกับประเภทของความเครียด ระยะเวลา ในการสัมผัสความเครียด และสถานะทาง สรีรวิทยาของเซลล์แต่ละเซลล์ (ภาพที่ 1) หลังเซลล์สัมผัสความเครียด (ภายในและ ภายนอก) เซลล์จะเกิดการบาดเจ็บได้สอง ประเภท (1) การบาดเจ็บในระดับเมตาบอ ลิก คือเกิดความเสียหายของส่วนประกอบ ต่างๆ ภายในเซลล์ เช่น กรดดีออกซีไร โบนิวคลีอิก (ดีเอ็นเอ) กรดไรโบนิวคลีอิก (อาร์เอ็นเอ) และเอนไซม์ที่มีความสำคัญ และ (2) การบาดเจ็บในระดับโครงสร้าง คือเกิดความเสียหายของผนังเซลล์และเยื่อ หุ้มเซลล์ ไม่ว่าจะเป็นการบาดเจ็บประเภท ใด การตรวจวิเคราะห์เซลล์ที่บาดเจ็บแต่ ยังมีชีวิตอยู่ (sublethally injured cells) ซึ่งรวมถึงเซลล์แบคทีเรียที่ทำให้เกิดโรคนั้น เปน็ ความท้าทาย เนื่องจากเซลล์เหล่านี้จะ ไม่เติบโตในอาหารเลี้ยงเชื้อเพิ่มปริมาณ (enrichment media) และอาหารเลี้ยง เช้อื บนจานเพาะเชื้อ (plating media) ที่ มีสารคัดเลือก (selective agent)
     เซลล์ที่บาดเจ็บอาจปรับตัวเองให้เข้า กับสิ่งแวดล้อมใหม่ คืนสภาพการทำงาน ของเซลล์และความสามารถในการก่อโรค (pathogenicity) ด้วยการซ่อมแซมเซลล์ที่ เสียหาย แล้วอยู่ในสถานะมีชีวิตแต่ไม่สามารถ เพาะเชื้อได้ (viable-but-nonculturable, VBNC) ซึ่งจะเป็นเซลล์ที่มีกิจกรรมเมตา บอลิซึมน้อยมากและไม่สามารถแบ่งตัว ได้ หรืออยู่ในสภาพบาดเจ็บแล้วตายไป การสัมผัสความเครียดปริมาณน้อย เซลล์ ส่วนใหญ่จะปรับตัวเข้ากับสิ่งแวดล้อมใหม่ และกลับมาเติบโตได้อีกครั้ง อย่างไรก็ตาม การสัมผัสกับความเครียดเป็นระยะเวลา นานจะทำให้ช่วงระยะพัก (lag phase) ของแบคทีเรียนานขึ้นและเกิดขึ้นพร้อมกับ กระบวนการเปลี่ยนแปลงทางสรีรวิทยา ชั่วคราวซึ่งอาจทำให้ทนทานต่อความเครียด ได้มากขึ้น สภาวะนี้เรียกว่า “การปรับตัว ชั่วคราว” (transient adaptation) เมื่อได้ รับความเครียดระดับปานกลาง กลุ่มเซลล์ จะประกอบด้วยเซลล์ปกติ เซลล์ตาย และ เซลล์ที่บาดเจ็บในระดับต่างๆ โดยทั่วไป การได้รับความเครียดรุนแรงจะฆ่าเซลล์ ทั้งหมด อย่างไรก็ตาม เซลล์ที่รอดชีวิต รวมถึงเชื้อก่อโรคในอาหาร อาจจะยังคง มีชีวิตอยู่ได้เนื่องจากมีการกลายพันธุ์ของ ยีนเพื่อปรับตัวให้อยู่รอดได้

ประเภทของความเครียด

ความเครียดทางเคมี
     ความเครียดทางเคมีมาจากการสัมผัส กรดและเบส สารกันเสียในอาหาร และสาร ฆ่าเชื้อชนิดต่างๆ ภาวะช็อกจากกรด (acid shock) อย่างรุนแรงและความเครียดทำให้ เซลล์อยู่ในสภาวะบาดเจ็บที่พีเอชต่ำ เมื่อ ไฮโดรเจนไอออน (H+) เคลื่อนผ่านเยื่อหุ้ม เซลล์หรือเมื่อกรดอินทรีย์แพร่ผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ แล้วทำให้ค่าพีเอชภายในเซลล์ลดลงจนทำให้ เซลล์แตก นอกจากนี้กระบวนการหมักที่ใช้ ในการผลิตชีสและผลิตภัณฑ์เนื้อสัตว์ชนิด ต่างๆ สามารถทำให้เกิดความเครียดจาก กรดได้ และการสัมผัสสารชำระล้างที่เป็น ด่าง และสารเคมี เช่น โซดาไฟ (NaOH) และสารประกอบควอเทอร์นารีแอมโมเนียที่ ใช้ทำความสะอาดและฆ่าเชื้อพื้นผิวสัมผัส อาหารและสิ่งที่ไม่ใช่อาหาร สามารถเหนี่ยว นำให้เซลล์บาดเจ็บได้เช่นกัน เซลล์เหล่านี้ จะตรวจวิเคราะห์ได้ยากเมื่อใช้วิธีมาตรฐาน คือ การเลี้ยงเชื้อบนจานเพาะเชื้อโดยใช้ อาหารเลี้ยงเชื้อเพิ่มปริมาณ

ความเครียดทางกายภาพ
     ความเครียดทางกายภาพเป็นผลมา จากการสัมผัสอุณหภูมิสูงและต่ำ การ ทำให้แห้ง การเปลี่ยนแปลงแรงดันออส โมติก กระบวนการฆ่าเชื้อด้วยแรงดันสูง และการฉายรังสี การช็อกจากความเย็น จะส่งผลถึงการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์ ที่จะหยุดชะงัก ความสามารถในการกลับ มาเจริญเติบโตอีกครั้ง หลังจากช่วงปรับ ตัว และการเปลี่ยนแปลงในกระบวนการ สังเคราะห์โปรตีน ความไวต่ออุณหภูมิต่ำ ของจุลินทรีย์มีความหลากหลายและขึ้น กับอัตราการลดลงของอุณหภูมิ ความหนา แน่นของประชากร และอัตราการเติบโตของ จุลินทรีย์นั้นๆ การช็อกจากความร้อนสามารถ ทำให้จุลินทรีย์มีความต้านทานอุณหภูมิได้ดี ขึ้นเมื่อจุลินทรีย์สัมผัสกับอุณหภูมิที่สูงกว่า ช่วงอุณหภูมิที่มันสามารถเติบโตได้ปกติ เช่น ระหว่างการฆ่าเชื้อผลิตภัณฑ์ไก่แบบ พาสเจอไรซ์ที่อุณหภูมิต่ำ การทำให้เนื้อ สุกแบบช้า หรือกระบวนการปรุงแบบซูวี (sous-vide) นอกจากนี้ค่าวอเตอร์แอคทิวิ ตีของอาหารที่ลดลงจากการเติมสารต่างๆ ที่สามารถจับน้ำลงในอาหาร เช่น น้ำตาลเกลือแกง (NaCl) และฟอสเฟต สามารถทำให้เกิดความเครียดจากออสโมติก ซึ่งจะพบระหว่างการแช่เยือกแข็ง การทำแห้ง และการระเหยน้ำออกจากอาหารอย่างรวดเร็ว

ความเครียดทางสารอาหาร
     ความเครียดทางสารอาหารสามารถ เกิดขึ้นได้ตามธรรมชาติและในสถานที่ผลิต อาหาร เมื่อระดับของสารอาหารมีปริมาณ ต่ำจนไม่สามารถสนับสนุนกิจกรรมเมตาบอ ลิซึมของเซลล์หรือการเติบโตของจุลินทรีย์ ได้ มีรายงานว่าพบความเครียดจากการ ขาดสารอาหารของจุลินทรีย์ในซากสัตว์ อาหาร บนพื้นผิวอุปกรณ์ ผนัง และพื้น โดย จุลินทรีย์ที่อยู่ในสภาพแวดล้อมที่ขาดแคลน อาหารมักผ่านขั้นตอนการปรับเปลี่ยนผิว เซลล์เพื่อให้สามารถใช้แหล่งพลังงานที่มี อยู่ การเปลี่ยนแปลงรูปร่างเซลล์ระหว่าง การขาดสารอาหารจะเกี่ยวข้องกับสัณฐาน วิทยาของเซลล์และองค์ประกอบของผนังเซลล์/เยื่อหุ้มเซลล์ รวมถึงเพิ่มการเกาะติดของแบคทีเรียและน่าจะเกี่ยวข้องกับการสร้างไบโอฟิล์มของจุลินทรีย์

การซ่อมแซมเซลล์และการป้องกันข้าม
     การผลิตโปรตีนที่เหนี่ยวนำด้วย ความเครียด (stress-induced protein) มีบทบาทสำคัญอย่างยิ่งในการปรับตัวของ จุลินทรีย์ เพื่อให้สามารถเจริญเติบโตได้ใน สภาวะที่จำกัดต่อการมีชีวิตรอด และการ คืนสภาพจากความเสียหายที่เหนี่ยวนำ ด้วยความเครียดทั้งจากการเปลี่ยนแปลง อุณหภูมิ พีเอช ออสโมลาริตี และสารอาหาร โปรตีนที่เหนี่ยวนำด้วยความเครียดบางชนิด มีหน้าที่ที่ชัดเจนในการจัดการความเครียด อย่างจำเพาะ ในขณะที่โปรตีนที่เหนี่ยว นำด้วยความเครียดชนิดอื่นๆ ถูกผลิตขึ้น ภายใต้สภาวะที่มีความเครียดหลากหลาย ชนิด โปรตีนจากการช็อกด้วยความร้อน (heat-shock protein) หลายชนิดถูก ผลิตขึ้นเพื่อตอบสนองต่ออุณหภูมิที่สูงขึ้น ซึ่งโปรตีนเหล่านี้บางชนิดถูกผลิตขึ้นหลังจากจุลินทรีย์สัมผัสกับความเครียดชนิดอื่นๆ ที่ไม่ใช่ความเครียดเนื่องจากอุณหภูมิ เช่น การขาดอาหาร และการสัมผัสเอทานอล และตัวทำละลายอินทรีย์อื่นๆ สารออกซิไดส์ และเกลือที่มีความเข้มข้นสูง
     ปรากฏการณ์ที่ความเครียดชนิดหนึ่งช่วย ป้องกันความเครียดชนิดเดียวกันในระดับสูง กว่า (โดยเฉพาะความร้อน) หรือป้องกัน ความเครียดที่ต่างชนิดกันมีการบันทึกไว้ มากมาย และเรียกว่า “การป้องกันข้าม” (cross protection) หรือ “ความต้านทาน เนื่องจากความเครียด” (stress hardening) เชื้อก่อโรคในอาหารที่สำคัญบางชนิด เช่น Escherichia coli O157:H7, Salmonella และ Listeria monocytoogenes แสดง ให้เห็นว่ามีความทนทานต่อความร้อนมาก ขึ้นเมื่อช็อกด้วยความร้อนจากอาหารเลี้ยง เชื้อในห้องปฏิบัติการ อาหารชนิดต่างๆ ที่มีสารอาหารจำกัดและค่าพีเอชที่เปลี่ยนแปลง อย่างรวดเร็ว บางครั้งทำให้จุลินทรีย์มีความต้านทานความร้อนเพิ่มขึ้น การป้องกันข้ามที่เพิ่มขึ้นหลังการสัมผัสความเครียดใดๆ จะมีความแตกต่างตามชนิด/สายพันธุ์จำเพาะของแบคทีเรีย และระดับและธรรมชาติของความเครียด

ความรุนแรงในการก่อโรค
     ยีนก่อโรคชนิดต่างๆ สามารถถูก เหนี่ยวนำเพื่อตอบสนองต่อความเครียด ต่างๆ เนื่องจากแบคทีเรียย้ายจากดิน น้ำ สภาพแวดล้อมในกระบวนการผลิตอาหาร หรือจากอาหาร สู่โฮสต์ที่เป็นมนุษย์ที่มี ความเครียดที่จำเพาะกับโฮสต์ที่เหมือนกับ ความเครียดในสิ่งแวดล้อมภายนอก เช่น การเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ ความเป็นกรด และออกซิเจนที่พร้อมใช้ การพัฒนาความ ทนทานต่อกรดจากการสัมผัสอาหารที่มีค่า พีเอชต่ำ (เช่น ไซเดอร์แอปเปิ้ล ชีส) หรือ กรดในกระเพาะอาหาร สามารถเพิ่มการอยู่ รอดซึ่งเป็นปัจจัยหลักในการทำให้มีการติด เชื้อต่ำ (low infective dose) เกิดขึ้น ในการแพร่ระบาดที่เกิดจากอาหารมากมาย สภาพแวดล้อมที่เกิดความเครียดจากสภาพ ขาดออกซิเจนในลำไส้เล็กสามารถเพิ่มความ รุนแรงในการก่อโรค (virulence) ของเชื้อ ก่อโรค ดังนั้น วิธีการทดสอบมาตรฐานที่ไม่สามารถตรวจวิเคราะห์เซลล์บาดเจ็บในตัวอย่างอาหารและตัวอย่างจากสิ่งแวดล้อมจึงทวีความน่าเป็นห่วงในการสาธารณสุข

การคืนสภาพและการตรวจวิเคราะห์ แบคทีเรียที่บาดเจ็บแต่ยังมีชีวิตอยู่
     วิธีมาตรฐานที่ยอมรับทั่วไปมีสองวิธี ได้แก่ การเพิ่มจำนวนและการเพาะเชื้อบนจานเพาะเชื้อโดยตรง เพื่อตรวจวิเคราะห์ว่ามี/ไม่มีจุลินทรีย์ และจำนวนของจุลินทรีย์เป้าหมาย ตามลำดับ ทั้งสองวิธีจะขึ้นกับการใช้สารคัดเลือก (selective agent) ต่างๆ เช่น สารปฏิชีวนะ กรด สี และสารลดแรงตึงผิว เพื่อกดการแข่งขันของเชื้อที่มีอยู่ตามธรรมชาติ (background flora)
     ในสภาวะนี้ เซลล์ที่ไม่บาดเจ็บในสภาพ ปกติเท่านั้นที่จะเติบโต ในกรณีที่ไม่มีสาร คัดเลือกเหล่านี้ เซลล์ที่บาดเจ็บจะซ่อมแซม เซลล์และกลับมีหน้าที่ดังเดิม ดังนั้นเซลล์ ที่คืนสภาพและซ่อมแซมเซลล์สมบูรณ์จะ สามารถเติบโตและแบ่งเซลล์ได้ตามปกติ เนื่องจากเซลล์ของเชื้อก่อโรคในอาหาร สามารถฟื้นคืนความรุนแรงในการก่อโรค หลังการซ่อมแซมเซลล์ จึงต้องมีขั้นตอน เพิ่มเติมเพื่อตรวจวิเคราะห์อาหาร (เช่น อาหารที่เป็นกรด อาหารหมักดอง อาหาร ความชื้นต่ำ และอาหารผ่านกระบวนการ) ที่มีโอกาสที่เซลล์จะสัมผัสความเครียดหรือ มีเซลล์บาดเจ็บ หรือเมื่อเก็บตัวอย่างจากสิ่ง แวดล้อมในกระบวนการผลิตอาหารด้วยการ ป้ายหรือซับพื้นผิว (swab or sponge) ที่ จุลินทรีย์อาจบาดเจ็บจากความแห้งหรือการ สัมผัสสารทำความสะอาดหรือสารฆ่าเชื้อ
     การฟื้นคืนของเซลล์บาดเจ็บในห้องปฏิบัติ การจะใช้อาหารเลี้ยงเชื้อเหลว (broth) และอาหารเลี้ยงเชื้อแข็ง (agar) แบบไม่ คัดเลือก (non-selective) อย่างไรก็ตาม อาหารเลี้ยงเชื้อเหล่านี้จะช่วยให้จุลินทรีย์ เป้าหมายและไม่ใช่เป้าหมายที่ไม่บาดเจ็บ ในตัวอย่างเติบโตด้วย และจะไม่สามารถ จำแนกจุลินทรีย์เป้าหมายจากเชื้อที่มีอยู่ ตามธรรมชาติ เมื่อการซ่อมแซมสมบูรณ์ เซลล์ที่คืนสภาพจะสามารถเลี้ยงให้ฟื้นคืน โดยใช้อาหารเลี้ยงเพื่อคัดเลือก/จำแนก (selective/differentiate) แบบเหลวและ แบบแข็ง โดยนิยามแล้ว เซลล์ที่บาดเจ็บ สามารถเติบโตได้เฉพาะในอาหารแบบไม่คัดเลือกหรืออาหารสำหรับเพาะเชื้อในจานเลี้ยงเชื้อเท่านั้น เมื่อเซลล์คืนสภาพแล้ว เซลล์ที่มีสุขภาพดีจะเติบโตได้ในอาหารเลี้ยงเชื้อทั้งมีหรือไม่มีสารคัดเลือก ดังนั้น สัดส่วนของเซลล์ที่บาดเจ็บในประชากรสามารถคำนวณได้
     เมื่อประเมินการอยู่รอดในอาหารที่ผ่านกระบวนการที่ใช้ความร้อนหรือกระบวนการที่ไม่ใช้ความร้อน ในการเพาะเชื้อในห้องปฏิบัติการ หากพบจุลินทรีย์บาดเจ็บ 90% หรือมากกว่าหลังจากสัมผัสความเครียดถือเป็นค่าวิกฤต

วิธีการเพิ่มปริมาณเชื้อจุลินทรีย์
     อาหารเลี้ยงเชื้อเหลวเพิ่มจำนวนแบบไม่คัดเลือกได้พัฒนาขึ้นมาหลายชนิดช่วยให้เซลล์แบคทีเรียซ่อมแซมตัวเองก่อนการ ใช้อาหารเลี้ยงเชื้อเพิ่มจำนวนและ/หรือการเลี้ยงเชื้อบนจานเพาะเชื้อเพื่อคัดเลือก ซึ่งสามารถเลือกใช้อาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อกำหนด จุลินทรีย์เป้าหมายที่จะให้ฟื้นคืนและตัวอย่างที่กำลังจะวิเคราะห์ ตัวอย่างอาหารเลี้ยงเชื้อที่ระบุไว้ในคู่มือการวิเคราะห์แบคทีเรีย ที่ตีพิมพ์โดยองค์การอาหารและยาแห่ง สหรัฐอเมริกา (US FDA) ในการฟื้นคืน เซลล์เชื้อจุลินทรีย์ก่อโรคจากอาหารที่บาด เจ็บ รวมถึงอาหารเ หลวเ บรน- ฮาร์ตอินฟิวชัน สำหรับเชื้อ E. coli สายพันธุ์ก่อโรค อาหาร เหลวแลคโทส อาหารเหลวนมผงขาดมันเนย เพื่อเพิ่มปริมาณเปปโตนวอเตอร์บัฟเฟอร์ หรืออาหารเหลวเพิ่มปริมาณอเนกประสงค์ สำหรับเชื้อ Salmonella การเลือกใช้จะขึ้น กับผลิตภัณฑ์อาหาร และอัลคาไลน์เปปโทน วอเตอร์สำหรับเชื้อ Vibrio spp. อุณหภูมิ และระยะเวลาในการบ่มเพื่อให้เซลล์บาด เจ็บซ่อมแซมจะขึ้นกับเชื้อก่อโรคเป้าหมาย ประเภทของความเครียดที่คาด และวิธีการ ที่ใช้ บ่มที่ 25-37 องศาเซลเซียส นาน 3-5 ชั่วโมง โดยทั่วไปจะเป็นอุณหภูมิที่เหมาะ สำหรับการคืนสภาพของเซลล์เชื้อก่อโรค ที่ชอบอุณหภูมิปานกลาง (mesophilic) (ภาพที่ 2) ขั้นตอนการตรวจวิเคราะห์และ การฟื้นคืนสภาพรวมถึงการการเพาะเชื้อบน จานเพาะเชื้อหรือการเพิ่มจำนวนเพื่อการ คัดเลือกทุติยภูมิ (secondary selective enrichment) อย่างไรก็ตาม สำหรับเชื้อ L. monocytogenes จะต้องบ่มตัวอย่าง ก่อนการเพิ่มปริมาณ (pre-enrichment) โดยใช้อาหารเลี้ยงเชื้อแบบเหลวเพิ่มปริมาณ ที่มีสารคัดเลือก อะคริเฟลวินไฮโดรคลอไรด์ กรดนาลิดิซิก และไซโคลเฮกซิไมด์ ซึ่งจะ เติมลงไปเมื่อบ่มเชื้อที่ 30 องศาเซลเซียส นาน 4 ชั่วโมง อีกทางเลือกหนึ่ง แคงและ ซิรากูซา เจือจางตัวอย่างอาหาร 2 เท่า ในเปปโทนวอเตอร์บัฟเฟอร์ และตามด้วย การเติมอาหารเหลวเพื่อการคัดเลือกเข้ม ข้นสองเท่า (double strength) เมื่อบ่ม ครบ 3 ชั่วโมง เพื่อคืนสภาพเซลล์แบคทีเรีย กลุ่มโคลิฟอร์มที่บาดเจ็บ วิธีนี้จะใช้ได้กับ จุลินทรีย์ชนิดอื่นๆ ด้วย อย่างไรก็ตาม ช่วงการเพิ่มจำนวนแบบไม่คัดเลือก การ บ่มต้องใช้ระยะเวลาน้อยที่สุด หากจะนับ จำนวนของจุลินทรีย์เป้าหมายโดยใช้การ เพาะเชื้อบนจานเลี้ยงเชื้อเพื่อการคัดเลือก ชนิดหรือใช้วิธีหาจำนวนเชื้อที่น่าจะเป็นที่สุด (most probable number, MPN) เนื่องจากผลการวิเคราะห์สุดท้ายมีโอกาสประมาณค่าเริ่มต้นสูงเกินไป
     ระหว่างการฟื้นคืนในอาหารเลี้ยงเชื้อแบบ ไม่คัดเลือก ไฮโดรเจนเพอร์ออกไซด์ที่สร้าง โดยจุลินทรีย์ที่ใช้ออกซิเจนชนิดอื่นมีความ เป็นพิษสูงมากต่อเซลล์ที่บาดเจ็บ เนื่องจาก กิจกรรมของเอนไซม์คาทาเลสและซูเปอร์ ออกไซด์ดิสมิวเทสลดลง จึงสามารถเติมคา ทาเลส ไพรูเวต กรด 3,3’-ไทโอไดโพรพิโอนิก หรือออไรเรส (เมืองแมนสฟิลด์ รัฐโอไฮโอ; ทำให้บริสุทธิ์เพื่อจำ หน่ายด้วยวิธีกรองด้วย เมมเบรนจากเชื้อ E. coli) เพื่อทำลาย ความเป็นพิษของไฮโดรเจนเพอร์ออกไซด์ การเติมทวีน 80 (ลิพิดและสารลดแรง ตึงผิวชนิดหนึ่ง) และแมกนีเซียมคลอไรด์ สามารถช่วยการซ่อมแซมเซลล์เมมเบรน และไรโบโซม ไม่ว่าจะใช้วิธีการใด เชื้อก่อ โรคในอาหาร เช่น Salmonella, Listeria, Campylobactor, E. coli และ Vibrio สามารถเข้าสู่สถานะ VBNC เซลล์ที่คืน สภาพได้ยากลำบาก ขนาดเชิงสัณฐานวิทยา ที่เล็กกว่า จำนวนเซลล์ที่มีเมตาบอลิซึมมี จำนวนน้อยกว่า ทำให้เซลล์ยังคงอยู่ในสภาพ นี้เป็นระยะเวลานาน อย่างไรก็ตาม ภาย ใต้สภาวะที่เหมาะสม เซลล์ที่สภาพเกือบ ไม่มีความเคลื่อนไหว (semi-dormant) จะกลับมาทำหน้าที่ได้เต็มที่และมีความ สามารถในการก่อโรค (pathogenicity) เช่นเดิมได้ ดังนั้น การตรวจวิเคราะห์จึงมีความสำคัญอย่างยิ่ง

วิธีการเพาะเชื้อในจานเพาะเชื้อ
     การเพาะเชื้อบนจานเพาะเชื้อมักใช้ วิเคราะห์จำนวนประชากรแบคทีเรีย โดยใช้ วิธีเพาะเชื้อที่ผิวอาหารเลี้ยงเชื้อ (surface plating) การเทจาน (pour plating) การ กรอง (ดูที่บท “การนับจำนวนเชื้อที่ใช้อากาศ ที่ชอบอุณหภูมิปานกลาง” “mesophilic aerobic plate count”) หรือวิธี MPN (ดูที่บท “วิธีการเพาะเชื้อจุลินทรีย์เพื่อ นับจำนวน” “culture methods for enumeration of microorganisms”) ซึ่งชนิดของจุลินทรีย์ที่เพาะจะกำหนดจาก การเลือกอาหารเลี้ยงเชื้อ อย่างไรก็ตาม ตามนิยาม เซลล์ที่บาดเจ็บจะไม่เติบโตบน อาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อการคัดเลือก (selective medium) ดังนั้น เมื่อสงสัยว่าอาจมีทั้ง เซลล์ปกติและเซลล์ที่บาดเจ็บ จะใช้ทั้ง อาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อการคัดเลือกและแบบไม่ คัดเลือกพร้อมกัน ซึ่งปัจจุบันเป็นที่รู้จักใน ชื่อเทคนิคการเทวุ้นทับ (agar overlay) โดยมีการใช้เทคนิคการเทวุ้นทับทั้งหมดสี่ วิธี ได้แก่ วิธีเทวุ้นทับ (pour-overlay plating) วิธีเทวุ้นทับผิว (surface-overlay plating) วิธีเทวุ้นทับแบบบาง (thin-layer agar) วิธีเทวุ้นทับแบบบางหลายส่วน (multi-compartment thin layer agar) อีกทางเลือกหนึ่ง วิธีการกรองหลายวิธีได้ รับการพัฒนาโดยใช้เมมเบรนมาตรฐาน ขนาด 0.45 ไมโครเมตร หรือตัวกรองไฮ โดรโฟบิกกริดเมมเบรน (hydrophobic grid membrane filter) ซึ่งจุลินทรีย์เป้า หมายจะถูกถ่ายจากอาหารเลี้ยงเชื้อแบบไม่ คัดเลือกสู่อาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อการคัดเลือก หลังจากการบ่มเป็นระยะเวลาสั้นๆ วิธีการ ทำให้ฟื้นคืนและการคืนสภาพเหล่านี้จะสรุป ได้ตามที่ผู้อ่านได้อ้างถึงบทความปริทรรศน์ของวู และตามบท “การนับจำนวนเชื้อที่ใช้อากาศที่ชอบอุณหภูมิปานกลาง” สำหรับรายละเอียดเฉพาะของการเตรียมตัวอย่าง สำหรับการเทลงจานเลี้ยงเชื้อ การเกลี่ยเชื้อ (spread) หรือการเพาะเชื้อบนผิวอาหารเลี้่ยงเชื้อ การกรองผ่านเมมเบรน และวิธีกรองผ่านไฮโดรโฟบิกกริดเมมเบรน

วิธีเทวุ้นทับ
     ในวิธีการนี้ ตัวอย่างที่เจือจางอย่าง เหมาะสมจะถูกเทลงในจานเลี้ยงเชื้อตามที่อธิบายในบท “การนับจำนวนเชื้อที่ใช้อากาศ ที่ชอบอุณหภูมิปานกลาง” โดยใช้วุ้นแบบไม่ คัดเลือก 5 ชนิด (ทริพทิเคสซอยอะการ์, เบรน-ฮาร์ตอินฟิวชันอะการ์, นิวเทรียนต์ อะการ์) ที่อาจเลือกเติมสารเติมแต่ง เช่น 44 www.innolabmagazine.com คาทาเลส ไพรูเวต หรือสารเติมแต่งอื่นๆ เพื่อช่วยเพิ่มอัตราการซ่อมแซมเซลล์ เมื่อ อาหารแข็งตัว บ่มที่ 25-37 องศาเซลเซียส นาน 3-5 ชั่วโมง เททับจานเลี้ยงเชื้อด้วย อาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อการคัดเลือกที่เหมาะ สมกับจุลินทรีย์เป้าหมาย (เช่น โมดิฟาย ออกฟอร์ดอะการ์ สำหรับเชื้อ Listeria ไว โอเลตเรดไบล์อะการ์ สำหรับเชื้อโคลิฟอร์ม) และจากนั้น ให้บ่มเชื้อ (ที่ 35-37 องศา เซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง) เพื่อคืนสภาพ จุลินทรีย์ที่สงสัย วิธีการนี้มอบปริมาณเชื้อ ที่มีความถูกต้องค่อนข้างดี เนื่องจากเซลล์ ทั้งหมดจะถูกจับไม่ให้เคลื่อนที่ในอาหารเลี้ยง เชื้อระหว่างการซ่อมแซมและการคืนสภาพ อย่างไรก็ตาม โคโลนีที่ฝังตัวในอาหารเลี้ยง เชื้ออาจจะถ่ายออกมาได้ยากเพื่อการจำแนก ชนิดในขั้นตอนต่อไป

วิธีเทวุ้นทับผิว
     ขั้นตอนแรกของวิธีการเทวุ้นทับผิว (รู้จัก กันในชื่อ วิธีการฟื้นคืนแบบเททับ (overlay resucination) อีกด้วย) มีความแตกต่าง จากวิธีการเทวุ้นทับหรือการเกลี่ยเชื้อ โดย มีพื้นผิวของตัวอย่างที่เจือจางอย่างเหมาะ สม หรือเกลี่ยบนจานเพาะเชื้อที่มีอาหาร เลี้ยงเชื้อแบบไม่คัดเลือก (เช่น ทริปทิเคส ซอยอะการ์ เบรนฮาร์ตอินฟิวชันอะการ์ นิวเทรียนต์อะการ์ อาจเติมคาทาเลส ไพรู เวต หรือสารเติมแต่งอื่นๆ เพื่อช่วยในการ ซ่อมแซมเซลล์) หลังจากบ่มที่ 25-37 องศา เซลเซียส นาน 3-5 ชั่วโมงเพื่อให้เซลล์คืน สภาพ เทอาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อการคัดเลือก 10-12 มิลลิลิตร ทับลงไป ให้เหมาะสมกับ จุลินทรีย์เป้าหมาย จากนั้นนำไปบ่มต่อตาม ที่ได้อธิบายในวิธีการเทวุ้นทับก่อนหน้านี้ ข้อได้เปรียบของวิธีนี้ที่เหนือกว่าวิธีการเท วุ้นทับ ได้แก่ (1) จานเลี้ยงเชื้อที่เทอาหาร เลี้ยงเชื้อไว้แล้ว นำมาใช้ในขั้นตอนแรกเพื่อ ให้ง่ายขึ้น และ (2) เซลล์คืนสภาพได้มาก ขึ้นเนื่องจากเซลล์ที่อาจบาดเจ็บถูกเทลง เพาะเชื้อบนจานโดยตรง แทนที่จะสัมผัส กับวุ้นที่ร้อนระหว่างการเทจาน

วิธีเทวุ้นทับแบบบาง
     วิธีการเทวุ้นทับแบบบางมีขั้นตอนเรียบ ง่ายเพียงขั้นตอนเดียว ใช้การแพร่ของสาร คัดเลือกจากอาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อคัดเลือก ที่อยู่ด้านล่างสู่อาหารเลี้ยงเชื้อแบบไม่คัด เลือกด้านบนในเวลา 3-6 ชั่วโมง ทำให้ วิธีการนี้เป็นอีกทางเลือกหนึ่ง ในขั้นตอน นี้ ให้เทอาหารเลี้ยงเชื้อสำหรับเทจานแบบ ไม่คัดเลือก 7 มิลลิลิตร ลงในจานที่เท อาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อการคัดเลือกปริมาตร 14 มิลลิลิตรไว้แล้ว เมื่อเกลี่ยจานหรือเท อาหารบนผิวอาหารเลี้ยงเชื้อทันทีหลังการ เตรียม ด้านบนของอาหารเลี้ยงเชื้อแบบไม่ คัดเลือกจะมอบสภาพแวดลอ้ มทีส่ นับสนนุ การคืนสภาพของเซลล์บาดเจ็บ หากการ บ่มดำเนินต่อไป เซลล์ที่คืนสภาพจะมี อันตรกิริยากับอาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อการคัด เลือกและสารที่มีความเข้มข้นแตกต่างกัน จะเคลื่อนตัวจากล่างขึ้นบนเพื่อสร้างโคโลนี ที่มีลักษณะทางสัณฐานวิทยาและการทำ ปฏิกิริยาการเกิดสีของจุลินทรีย์เป้าหมาย ที่ต้องสงสัย ดังนั้น อัตราส่วนของอาหาร เลี้ยงเชื้อเพื่อการคัดเลือก (ประมาณ 2:1) เป็นสิ่งสำคัญในการคืนสภาพจุลินทรีย์เป้า หมายให้ได้มากที่สุดและมีจุลินทรีย์ตาม ธรรมชาติอื่นๆ น้อยที่สุด
     ตรงข้ามกับวิธีการเทวุ้นทับและวิธีการ เทวุ้นทับผิว วิธีเทวุ้นทับแบบบางจะขจัด ความเสี่ยงของการบาดเจ็บของเซลล์จาก การสัมผัสกับวุ้นเหลวและเชื้อสร้างโคโลนี ใต้วุ้นซึ่งสามารถแยกเพื่อทำการจำแนกต่อ ไป วิธีการนี้ผ่านการทดสอบแล้วว่าประสบ ความสำเร็จในการคืนสภาพเชื้อก่อโรคใน อาหารที่บาดเจ็บจากความร้อน กรด และ อุณหภูมิต่ำ รวมถึง E. coli O1057:H7, L. monocytogenes, S. typhimurium, Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus และ Yersinia enterocolitica

วิธีเทวุ้นทับแบบบางหลายส่วน
     วิธีเทวุ้นทับแบบบางหลายส่วนเป็นวิธี ที่ปรับปรุงจากวิธีเทวุ้นทับแบบบางซึ่งใช้วิธี การแบ่งจานเลี้ยงเชื้อ (petri plate) ออก เป็นสอง สาม หรือสี่ส่วน แต่ละส่วนจะมี อาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อการคัดเลือกที่แตกต่าง กัน แล้วเททับด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อแบบไม่ คัดเลือกเพื่อคืนสภาพและแยกเชื้อจุลินทรีย์ ต่างชนิดกัน ( เช่น Listeria, Salmonella, E. coli, และ Yersinia) วิธีการนี้จะมอบ ประสิทธิภาพของการใช้อาหารเลี้ยงเชื้อ แรงงาน และเวลา แต่การตรวจวิเคราะห์และ การระบุจำนวนจุลินทรีย์ที่มีปริมาณน้อยให้ มีความแม่นยำอาจจะมีปัญหา เพราะพื้นที่ ผิวสำหรับจุลินทรีย์แต่ละชนิดมีน้อยกว่า

วิธีกรองผ่านเมมเบรน
     วิธีกรองผ่านเมมเบรนบางวิธีได้รับ การพัฒนา โดยใช้วิธีดั้งเดิมที่รายงานโดย กอฟฟ์ และคณะ ตัวอย่างอาหารที่เจือจาง อย่างเหมาะสมถูกกรองผ่านเมมเบรนปลอด เชื้อขนาด 47 มิลลิเมตร (ขนาดรู 0.45 ไมโครเมตร) ตามที่อธิบายในบท “การนับ จำนวนเชื้อที่ใช้อากาศที่ชอบอุณหภูมิปาน กลาง” นำเมมเบรนไปบ่มในอาหารเลี้ยง เชื้อแบบไม่คัดเลือกนาน 3-6 ชั่วโมง และ จากนั้นย้ายไปบ่มในอาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อการ คัดเลือกอีก 18 ชั่วโมง วิธีการนี้จะเหมาะ สมที่สุดสำหรับเชื้อจุลินทรีย์เป้าหมายที่ สงสัยที่มีปริมาณน้อย แต่เศษอาหารขนาด เล็ก (particulate) อาจอุดตันเมมเบรน และทำให้กรองได้ยาก แอนเดอร์สัน และ เบียร์ด-ปาร์กเกอร์ เสนอวิธีกรองโดยใช้ เมมเบรนอีกทางเลือกหนึ่ง โดยใช้วิธีเกลี่ย ตัวอย่างที่เป็นเนื้อเดียวกันและเจือจางอย่าง เหมาะสมแล้วบนเมมเบรนโดยตรง แล้วนำ ไปบ่มบนอาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อการคัดเลือก จากนั้นนำไปบ่มบนอาหารเลี้ยงเชื้อแบบไม่ คัดเลือก หลายปีหลังจากนั้น แบลกเบิร์น และแมคคาร์ที ได้ใช้วิธีเดียวกันนี้ โดย ใช้อาหารเลี้ยงเชื้อทริปทิเคสซอยอะการ์ และซอร์บิทอลแมคคอนคีย์อะการ์เพื่อคืน สภาพเซลล์ E. coli O157:H7 ที่บาดเจ็บ อย่างไรก็ตาม สารกันเสียหรือสารคัดเลือก ที่อยู่ในเศษอาหารขนาดเล็กอาจส่งผลกระ ทบในทางลบต่ออัตราการซ่อมแซมเซลล์บน ตัวกรองเมมเบรน

วิธีกรองผ่านไฮโดรโฟบิกกริดเมมเบรน
     การกรองผ่านเมมเบรนไฮโดรโฟบิกได้ถูก ดัดแปลงเพื่อใช้คืนสภาพจุลินทรีย์ที่บาดเจ็บ ในขั้นตอนนี้ ตัวอย่างอาหารที่เจือจางอย่าง เหมาะสมจะถูกกรองผ่านตัวกรองขั้นต้น Jan-Feb 45 (prefilter) ปลอดเชื้อ เพื่อขจัดเศษอาหาร ขนาดเล็ก แล้วนำไปกรองผ่านตัวกรองเมมเบรน ที่แบ่งพื้นที่ให้จุลินทรีย์เติบโตเป็น 1,600 ส่วน ซึ่งจะป้องกันไม่ให้จุลินทรีย์ขยายตัว เป็นวงกว้าง จากนั้น สามารถถ่ายเมมเบรน ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อการคัดเลือก แล้ว ถ่ายไปที่อาหารเลี้ยงเชื้อแบบไม่คัดเลือก หรือถ่ายไปจานที่เทวุ้นทับแบบบางเพื่อให้ จุลินทรีย์เป้่าหมายที่สงสัยซ่อมแซมและคืน สภาพ วิธีการนี้จะแตกต่างจากวิธีการเพาะ เชื้อบนจานอื่นๆ เนื่องจากวิธีกรองด้วย ไฮโดรโฟบิกกริดเมมเบรนให้ผลการวิเคราะห์ เป็นค่า MPN แทนที่จำนวนโคโลนีบนจาน เลี้่ยงเชื้อ เนื่องจากจุลินทรีย์หลายชนิดอาจ เติบโตในพื้นที่ (compartment) เดียวกัน หลังการกรอง

ข้อจำกัดและบทสรุป
     สถานะทางกายภาพของประชากร จุลินทรีย์ใดๆ จะเปลี่ยนแปลงหลังจาก การสัมผัสความเครียดทางเคมี กายภาพ หรือทางสารอาหาร โดยอาจมีประชากร ที่ถูกทำลาย บาดเจ็บในระดับต่างๆ ใน สัดส่วนต่างๆ ความต้านทานที่เพิ่มขึ้น ของเชื้อก่อโรคในอาหารต่อความเครียดที่ ได้รับหลังจากนั้น เรียกว่า “การป้องกัน ข้าม” (cross protection) เป็นภัยคุกคาม สำคัญต่อสาธารณสุข เนื่องจากจุลินทรีย์ เหล่านี้สามารถซ่อมแซมและกลับมามีความ รุนแรงในการก่อโรคได้เช่นเดิม การใช้วิธีการ เพาะเชื้อเพื่อการคัดเลือกร่วมกับการเพาะ เชื้อแบบไม่คัดเลือกสามารถใช้ในการฟื้น คืนและคืนสภาพของแบคทีเรียที่บาดเจ็บ ขึ้นกับจุลินทรีย์จำเพาะที่สงสัย โดยความ สามารถในการคัดเลือก (selectivity) ของ อาหารเลี้ยงเชื้อจะแปรผกผันกับอัตราการ ซ่อมแซม วิธีการเพาะเชื้อบนจานเพาะเชื้อ โดยตรงเพื่อการฟื้นคืนจุลินทรีย์เชิงปริมาณ ที่ใช้กันในปัจจุบัน ได้แก่ การเทวุ้นทับ (pour-overlay plating) และวิธีเทวุ้น ทับผิว (surface-overlay plating) และ การเทวุ้นทับแบบบาง (thin-layer agar) และวิธีเทวุ้นทับแบบบางหลายส่วน (multicompartment thin layer agar) วิธี ทางเลือกด้วยการใช้เมมเบรน ได้แก่ การ กรองโดยใช้เมมเบรน (หรือการเพาะเชื้อจาก ตัวกรองเมมเบรนบนจานเพาะเชื้อโดยตรง) และการกรองโดยใช้ไฮโดรโฟบิกกริดเมมเบรน เนื่องจากแบคทีเรียที่บาดเจ็บมีโอกาสมี ชีวิตในอาหารและอยู่ในสิ่งแวดล้อมของ กระบวนการผลิตอาหาร การตรวจวิเคราะห์ แบคทีเรียเหล่านี้เป็นส่วนหนึ่งของคุณภาพ และความปลอดภัยของอาหารที่มีความ สำคัญอย่างยิ่ง



Copyright © 2018 All Right Reserved. MEDIA MATTER Company